CRISPR 火了这么久，到底是怎么一回事？有啥用？怎么工作的？今天我们就一起来看看。

CRISPR、CRISPR/Cas、CRISPR/Cas9

CRISPR ：英文全称是 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇的间隔短回文重复，是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。

CRISPR/Cas ：英文全称是 Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated （Cas） systems， 是原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。

CRISPR/Cas 系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。

CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。其机理如下图所示。

CRISPR 发现历史

在1987 年的一篇论文中，日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时，发现了邻近的一个不同寻常的 DNA 片段，这一 DNA 片段中间是一段短直接重复核苷酸序列，两侧为短特异片段。他们当时指出这些序列的生物学意义尚不清楚。

这个还是从我们最熟悉的 E.coli，最经典的 K-12 株系中发现的，与 CRISPR 沾边的，就是这个回文序列。这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字。

直到 2002 年，研究人员通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被 21-37 bp 的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字 CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一些 CRISPR-associated 基因，也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列 Cas蛋白。

于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了 CRISPR 系统中最重要的三大元件—spacer（白色方块），回文 repeats（双三角），cas 等基因。

2013 年 2 月 15 日发表在《科学》（Science）的两篇文章，证明 Cas9 系统能在 293T，K562，iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组（HR）效率在3-25%之间，与 TALEN 酶切效果相当。文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。

曾构建第一只转基因小鼠的 Rudolf Jaenisch 教授采用 CRISPR/Cas 技术成功构建了同时携带多个基因突变的小鼠。CRISPR/Cas 技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，且可绕开胚胎干细胞操作过程。该技术重新定义了模式动物。

CRISPR 如何工作

阶段 1：外源 DNA 采集

外源核苷酸是通 过Cas 蛋白识别，入侵的短片段 DNA（ 30-50 个碱基对）被称为 protospacers，作为间隔序列插入宿 主CRISPR 位点中，由重复序列隔开。

对于 I 型和 II 型系统来说，protospacers 来自入侵 DNA 中两侧出现 2-5 个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。

一般 protospacers 连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及 Cas1、Cas2 和 游离3’-hydroxyls 等元件的机制，牵引序列。Protospacer 的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

阶段 2：crRNA 合成

CRISPR RNA 在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的 CRISPR 衍生 RNAs（crRNAs），这些 crRNAs 每一个都包含有对应于之前遇到的外源 DNA 的对应序列。

阶段 3：靶向干扰

成熟的 crRNAs 能指导 Cas 蛋白靶向互补靶标，靶标序列由专用 Cas 核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I 型和 II 型系统都可以靶向包含 PAM 和protospacer 互补序列的 dsDNA 底物。

用一张图来表示就是下面这样：

参考文献

RNA-Guided Human Genome Engineering viaCas9 Science. 2013 Feb 15 339(6121):823-6.

Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems Science. 2013 Feb 15 339(6121):819-23.

One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPRCas-Mediated Genome Engineering. Cell, Volume 153,Issue 4,910-918.

MoSnapShot: CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems,Cell 163.

来源：生物学霸